干细胞培养方法

MEF P0细胞培养Protocol

复苏：

1. 将MEF P0细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。

2. 将冻存管内细胞悬液转移至含3-4 ml MEF完全培养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min。

3. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的MEF完全培养液2 ml，吹打悬浮。

4. 轻轻吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。

5. 按照MEF细胞说明书上建议的复苏培养体系转移至1个T75培养瓶中培养，加入培养液14 ml。

6. 放入37℃培养箱内培养。

7.复苏第二天观察，如死细胞较多，更换新鲜的MEF完全培养液，可以使细胞生长的更好。

 

传代：

1. 待细胞长到90%-100%满时进行传代，一般3-4天，具体视细胞生长情况而定。

2. 吸除废液。

3. 用PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。

4. 加入2.5 ml的0.25%胰酶（含EDTA）至培养瓶，轻轻晃动，使胰酶覆盖底面，置于37℃培养箱内消化细胞。

5. 在显微镜下观察，直至细胞层全部脱落（一般需要1-2 min）。

6. 加2.5 ml MEF完全培养液终止消化。

7. 多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液。

8. 按照1:2-1:3的比例进行传代。

9. 放入37℃培养箱内培养。

 

冻存：

1. 按传代的方法将细胞消化下来，制成细胞悬液。

2. 以1000 rpm，离心5 min，弃上清，逐滴加入已经预冷的冻存液，悬浮细胞。

3. 按每支冻存管内加入500 ml细胞悬液分装到冻存管内，标记细胞名称、代数、冻存日期等基本信息。

4. 将冻存管置于程序降温盒内，-80℃过夜，转入液氮。

冻存液配方：MEF完全培养液80%，FBS10%，DMSO10%

 

丝裂霉素C处理：

1. 一般地，P0代MEF细胞传至P3代时，可以进行丝裂霉素C（Sigma，M0503）处理。处理过后的MEF细胞不再增殖，可直接作为feeder使用。

2. 传至P3代的MEF细胞长至80%以上时，吸出旧的MEF完全培养液，加入含丝裂霉素C（终浓度10 μg/ml）的新鲜MEF完全培养液（以T75培养瓶为例，加入培养液的体积为10 ml）。37℃培养箱温育处理3小时。

3. 吸出培养液，用PBS快速洗4遍以去除残余的丝裂霉素C。

4. 消化细胞、细胞计数并冻存。一般地，一个T25培养瓶铺1×10⁶细胞。

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