Culture Methods
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肿瘤细胞培养基本方法
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干细胞培养基本方法


Culture Methods for Tumor Cells

一)准备和安装过滤器  
清洗好过滤器，干燥，放入一张孔径0.22μm的微孔滤膜，用布包装好，15磅20 min进行高压灭菌处理。 在超净台内打开过滤器架好，胶管一端接入滤泵再插入待除菌的液体中，出口端胶管深入到已消毒好的瓶子中。用泵过滤，过滤后要检查滤膜是否完好无损。 

(二)合成培养基的配制 
1、根据细胞目录中的说明，按下表选择合适品牌及货号的培养基干粉，用适量超纯水充分溶解。

培养基 品牌 货号
培养基 品牌 货号
D-MEM/F-12 GIBCO 12400024
Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM), powder (high glucose) GIBCO 12800017
F-12 Nutrient Mixture (Ham) powder GIBCO 21700075
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) powder GIBCO 12200036
Leibovitz's L-15 Medium powder GIBCO 41300039
McCOY's 5A SIGMA M4892
Minimum Essential Medium (MEM) Alpha Medium powder (MEMα)
with ribonucleosides and deoxyribonucleosides		 GIBCO 11900024
Minimum Essential Medium (MEM) Alpha Medium powder (MEMα)
without ribonucleosides and deoxyribonucleosides		 GIBCO 12000022
Minimum Essential Medium (MEM) powder GIBCO 41500034
NUTRIENT MIXTURE F12 HAM KAIGHN'S
MODIFICATION (F12K)		 SIGMA N3520
RPMI Medium 1640 GIBCO 31800022
EGF SIGMA E9644
Sodium pyruvate SIGMA P2256-25G
MEDIUM 199, WITH EARLE'S SALTS AND L-GLUTAMINE, WITHOUT SODIUM BICARBONATE. CELL CULTURE TESTED SIGMA M5017

2、 按要求添加碳酸氢钠、谷氨酸钠、HEPES等，充分搅拌使之溶解。 
3、 调 pH至7.2左右。 
4、 加水至最终体积。 
5、 在超净台中对溶液进行滤过除菌，分装入250 mL或500 mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞紧瓶口。 
6、 瓶口封好，4℃冰箱贮存。

  (三)小牛血清的处理 
市场上出售的小牛血清一般做了灭菌处理，但在使用前还应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体(近来也有观点认为热灭活处理是不必要的)。胎牛血清不必灭活。 
1、 将血清加热至56℃并保持30 min，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。 
2、 处理后的血清贮存于4℃。 
3、 小牛血清在使用前最好进行筛选以掌握血清的质量。 

(四)生长培养基的配制 
除无血清培养之外，各种合成培养基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和抗菌素。 
1、培养基分装成小瓶(100～200 mL)以便使用，翻帽塞塞紧瓶口。 
2、按如下比例配制： 基本培养基占80％~90％，小牛血清或胎牛血清占10％~20％。 按1％体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U／mL和100 μ／mL，。 

(五)冻存细胞的复苏 
1、应遵守慢冻快融的原则。先将水浴锅调至37-37。5度，取出冻存的细胞迅速放入后将细胞面浸至水面以下不断摇动至融化。 
2、将解冻后的细胞液在常温条件下，1000rpm离心5分钟。 
3、弃上清，用少量培养基将细胞悬起，将细胞悬液转移至事先加入5ml完全培养基的T-25培养瓶中。将细胞混匀后，置培养箱中培养。

 (六)传代: 
1、贴壁细胞: 
对于贴壁细胞应先吸(倒)尽培养基，吸的越干净越好，以免中和后加入的消化液，使强度减弱（或PBS洗1－3次）。50ml培养瓶加入消化液约1-3ml，按此比例进行消化，(根据经验)，晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2-5分钟，镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后，轻轻振动瓶底使细胞全部脱落，加入2-3ml完全培养基后，轻轻吹打，使细胞基本成单个悬浮，然后分置其它无菌培养瓶内，加入完全培养基后继续培养或实验。 
2、悬浮细胞: 
一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内，加入完全培养基继续培养，如要高浓度可先离心1000rpm，5min后加入完全培养基，轻轻吹匀后，分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养。 

(七)冻存 
将贴壁细胞消化后离心收集，悬浮细胞直接离心收集，以完全培养基或胎牛血清重悬细胞至终浓度约106/ml。加入10%的DMSO。以每管1～2ml分装至冻存管中。用绝热材料包裹置-70摄氏度冰箱冷冻过夜。次日保存到液氮中。 

(八)注意事项 
1、玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒:1)高压蒸汽灭菌15分钟以上;2)干烤消毒140度2小时以上; 
2、无菌工作台先清洗后用75%酒精擦拭干净，紫外线照射40分钟以上;各种培养板照射3小时以上; 
3、培养基(pH7.2)和血清配制好后要做无菌试验:将血清按10%加入培养基内，用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取完全培养基5-10ml置培养箱内培养2-3天，肉眼见无浑浊或沉淀等异物。分装后置4度保存; 
4、消化液(pH7.8)或其它加入液，应用高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤除菌，分装成支置-20度保存; 
5、培养箱应先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍(如有紫外线的应照射1小时以上，如有高温灭菌的应按程序来菌)。至少每月一次。 
6、进入操作时应注意先清洗双手及手腕，然后用75%酒精擦拭，操作时注意无菌台内空间层次。手及物品不要在暴露的瓶口上方来往，如果数量较多，培养瓶应放在与酒精灯平行地方便于操作，瓶与瓶之间应相隔一定的距离，开瓶(盖)时应先用75%酒精反复擦拭或用灯烧，打开后应用灯先烧口，然后烧盖。用完后同样操作。整个操作过程尽量在无菌台靠里面一点。



Culture Methods for Stem Cell
MEF P0细胞培养Protocol

复苏：

  1. 将MEF P0细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
  2. 将冻存管内细胞悬液转移至含3-4 ml MEF完全培养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min。
  3. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的MEF完全培养液2 ml，吹打悬浮。
  4. 轻轻吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。
  5. 按照MEF细胞说明书上建议的复苏培养体系转移至1个T75培养瓶中培养，加入培养液14 ml。
  6. 放入37℃培养箱内培养。
  7. 复苏第二天观察，如死细胞较多，更换新鲜的MEF完全培养液，可以使细胞生长的更好。

传代：

  1. 待细胞长到90%-100%满时进行传代，一般3-4天，具体视细胞生长情况而定。
  2. 吸除废液。
  3. 用PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。
  4. 加入2.5 ml的0.25%胰酶（含EDTA）至培养瓶，轻轻晃动，使胰酶覆盖底面，置于37℃培养箱内消化细胞。
  5. 在显微镜下观察，直至细胞层全部脱落（一般需要1-2 min）。
  6. 加2.5 ml MEF完全培养液终止消化。
  7. 多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液。
  8. 按照1:2-1:3的比例进行传代。
  9. 放入37℃培养箱内培养。

冻存：

  1. 按传代的方法将细胞消化下来，制成细胞悬液。
  2. 以1000 rpm，离心5 min，弃上清，逐滴加入已经预冷的冻存液，悬浮细胞。
  3. 按每支冻存管内加入500 ml细胞悬液分装到冻存管内，标记细胞名称、代数、冻存日期等基本信息。
  4. 将冻存管置于程序降温盒内，-80℃过夜，转入液氮。

冻存液配方： 
MEF完全培养液80%，FBS10%，DMSO 10%

丝裂霉素C处理：
  1. 一般地，P0代MEF细胞传至P3代时，可以进行丝裂霉素C（Sigma，M0503）处理。处理过后的MEF细胞不再增殖，可直接作为feeder使用。
  2. 传至P3代的MEF细胞长至80%以上时，吸出旧的MEF完全培养液，加入含丝裂霉素C（终浓度10 mg/ml ）的新鲜MEF完全培养液（以T75培养瓶为例，加入培养液的体积为10ml ）。37℃培养箱温育处理3小时。
  3. 吸出培养液，用PBS快速洗4遍以去除残余的丝裂霉素C。
  4. 消化细胞、细胞计数并冻存。一般地，一个T25培养瓶铺1´106细胞。

MEF细胞铺制：
一. 作为【小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS 细胞】用饲养层时的使用方法：

  1. 在T25培养瓶中加入0.2%明胶，摇匀后覆盖底面即可，于37℃细胞培养箱中至少放置15 min以上。
  2. 吸除0.2%明胶，加入事先水浴加热至37℃的MEF完全培养液。一般地，一个T25培养瓶中约加入5 ml MEF完全培养液。
  3. 按实验需要：mES使用KM-r P3 MEF；小鼠iPS使用ICR-r P3 MEF或都使用CF-1-r P3 MEF，复苏MEF细胞若干支。将冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
  4. 将冻存管内细胞悬液转移至含2 ml MEF完全培养液的15 ml离心管内，以    1000 rpm，离心5 min，离心后将上清液吸除，按照MEF细胞说明书上建议的复苏培养体系，另加入新鲜的MEF完全培养液2 ml，重悬后平均加入到T25培养瓶中，轻轻摇匀后置于37℃细胞培养箱培养。24 h以后可以传入小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞。

二. 作为【人胚胎干细胞】用饲养层时的使用方法：

  1. 在T25培养瓶中加入5%Matrigel，摇匀后覆盖底面即可，于37℃细胞培养箱至少放置30 min以上。
  2. 吸除Matrigel，加入事先水浴加热至37℃的MEF完全培养液。一般地，一个T25培养瓶中加入5 ml MEF完全培养液。
  3. 按实验需要复苏CF-1-r P3 MEF若干支。将冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
  4. 将冻存管内细胞悬液转移至含2 ml MEF完全培养液的15 ml离心管内，以    1000 rpm，离心5 min，离心后将上清液吸除，按照MEF细胞说明书上建议的复苏培养体系，另加入新鲜的MEF完全培养液2 ml，重悬后平均加入到T25培养瓶中，轻轻摇匀后置于37℃细胞培养箱培养。24 h以后可以传入人胚胎干细胞。
人诱导型多能干细胞（hiPS）培养Protocol

以下试剂和方法来自ATCC，仅供参考。若选用其它品牌的培养液请与您的试剂提供商联系。
hiPS无饲养层完全培养液（ATCC，ACS-3002），hiPS无饲养层消化液（ATCC，ACS-3010），hiPS无饲养层冻存液（ATCC， ACS-3020），基质胶（ATCC，ACS-3035），ROCK Inhibitor Y27632（ATCC，ACS-3030）

复苏：

  1. 将人iPS细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
  2. 用1 ml移液器轻柔地将冻存管内液体转移到15 ml离心管中。
  3. 在上述离心管内逐滴加入温育好的4 ml hiPS无饲养层完全培养液，一边加一边晃动离心管。
  4. 离心1000 rpm，5 min。
  5. 将上清丢弃，轻弹离心管底部使细胞团松散。
  6. 加入1ml含有ROCK Inhibitor Y27632的hiPS无饲养层完全培养液，非常轻柔地吹打2-3次。不可过度吹打，避免细胞被分散成单细胞。
  7. 将铺过基质胶的培养皿从培养箱取出，吸掉多余的液体，加入含有ROCK Inhibitor Y27632的培养液3 ml。
  8. 将第6步中离心管内的细胞悬液转移到皿内，使细胞铺散均匀，置37℃，5% CO2 培养箱内培养。
  9. 24h后，换新鲜的不加ROCK Inhibitor Y27632的hiPS无饲养层完全培养液。
  10. 每天换液。ROCK Inhibitor Y27632仅在复苏和传代时添加（1:1000），日常换液不用添加。

传代：

  1. 将所需的所有试剂均在37℃水浴温热。
  2. 将培养皿内的培养液弃掉，用DPBS漂洗2遍，弃掉。
  3. 加入2 ml hiPS无饲养层消化液。
  4. 37℃孵育10-15分钟，期间注意观察，直到每个克隆的边缘都向中心卷起。
  5. 将hiPS无饲养层消化液吸掉，轻轻地加入4ml DMEM:F12培养液并晃动培养皿，吸掉。
  6. 加入2 ml含有ROCK Inhibitor Y27632的培养液，用1 ml移液器吹打皿底或用无菌的细胞刮使细胞脱落。避免吹打过度。
  7. 将细胞转移至15 ml离心管，并再次加入3 ml含有ROCK Inhibitor Y27632的培养液将培养皿冲洗一次，收集到离心管内。
  8. 离心1000 rpm，5 min。
  9. 将上清丢弃，轻弹离心管底部使细胞团松散。
  10. 加入2 ml含有ROCK Inhibitor Y27632的hiPS无饲养层完全培养液，非常轻柔地吹打2-3次。不可过度吹打，避免细胞被分散成单细胞。
  11. 将细胞分到预铺了基质胶的培养皿内培养。
  12. 每天换液，4-5天传代一次，传代比例为1:2-1:6。当出现下列任何一种情况时，需要进行传代：细胞汇合度达到90%；干细胞克隆过大，中央细胞生长不良；克隆有开始分化的迹象。

冷冻：

  1. 参照传代步骤1-9，hiPS无饲养层冻存液4℃保存，不需要预热。
  2. 在离心管内加入2 ml细胞冻存液，轻轻吹打，避免过度吹打。
  3. 将细胞悬液分装到贴好标签的冻存管内，每管0.5 ml。
  4. 将冻存管放入程序降温仪，置-80℃。
  5. 24h后，冻存管转入液氮保存。
人胚胎干细胞（hES）培养Protocol

MEF细胞铺制：

  1. 在T25培养瓶中加入5% Matrigel，摇匀后覆盖底面即可，于37℃细胞培养箱中至少放置30 min以上。
  2. 吸除Matrigel，加入事先水浴加热至37℃的MEF完全培养液。一般地，一个T25培养瓶中加入5 ml MEF完全培养液。
  3. 按实验需要复苏MEF若干支。将冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
  4. 将冻存管内细胞悬液转移至含2 ml MEF完全培养液的15 ml离心管内，以    1000 rpm，离心5 min，离心后将上清液吸除，另加入新鲜的MEF完全培养液1 ml，重悬后按照一个T25培养瓶铺1´106的MEF细胞，平均加入到T25 培养瓶，轻轻摇匀后置于37℃细胞培养箱。48h以后可以传入人胚胎干细胞。
  5. 复苏或传代hES细胞前，将T25培养瓶中的MEF完全培养液吸除，加入2 ml hES完全培养液轻轻冲洗一遍后吸除，加入新鲜的hES完全培养液待用。

复苏：

  1. 将hES细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
  2. 将冻存管内细胞悬液转移至含3-4 ml hES完全培养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min。
  3. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的hES完全培养液2-3 ml，吹打一次使细胞悬浮。
  4. 转移至1个已经铺好MEF细胞的T25培养瓶中培养。
  5. 复苏第二天不换液，第三天起每天更换hES细胞完全培养液。
注意：复苏后48小时换液，期间最好不要挪动细胞。hES复苏后大约4-5天才开始有克隆出现。


传代：

  1. 一般在复苏后第7-10天传代，正常传代为7天一次。
  2. 吸除废液。
  3. 用PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。
  4. 加入4-5 ml的1 mg / ml的Collagenase-type IV至培养瓶，轻轻晃动，使之覆盖底面，置于37℃培养箱内消化细胞。
  5. 在显微镜下观察，直至克隆边缘大部分脱落（一般需要30-60 min）。
  6. 用10 ml移液管轻轻吹打，将克隆吹下，细胞悬液转移至15 ml离心管中，放置一会，待克隆自然沉降后将上层Collagenase-type IV吸除，加入hES完全培养液3 ml，放置一会，待克隆自然沉降后将上层培养液吸除。
  7. 加入的hES完全培养液3 ml，用10 ml移液管吹打2-3次，细胞自然沉降，将上层吹打的过小的克隆及培养液吸除，加入hES完全培养液3 ml，悬浮细胞，按照1:4的比例进行传代。
  8. 放入37℃培养箱内培养。
  9. 第二天不换液，第三天起每天换液，换液前显微镜下将分化的克隆挑除。
注意：复苏后48小时换液，期间最好不要挪动细胞。hES复苏后大概4-5天才开始有克隆出现。


冻存：

  1. 按传代的方法将细胞消化下来，制成细胞悬液。
  2. 细胞自然沉降，吸除上层培养液，逐滴加入已经预冷的冻存液，轻轻悬浮细胞。
  3. 按每支冻存管内加入500 ml细胞悬液分装到冻存管内，标记细胞名称、代数、冻存日期等基本信息。
  4. 将冻存管置于程序降温盒内，-80℃过夜，转入液氮。

冻存液配方：
hES完全培养液60%，ES级FBS 30%，DMSO 10%

人脐带间充质干细胞培养Protocol

复苏：

  1. 将人脐带间充质干细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
  2. 将冻存管内细胞悬液转移至含3-4 ml人间充质干细胞（hMSC）完全培养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min。
  3. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的人间充质干细胞完全培养液2 ml，吹打悬浮。
  4. 轻轻吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。
  5. 按照人脐带间充质干细胞说明书中建议复苏培养体系转移至一个T25培养瓶中培养，加入培养液6 ml。
  6. 放入37℃培养箱内培养。
  7. 复苏第二天观察，如死细胞较多，更换新鲜的人间充质干细胞完全培养液，可以使细胞生长的更好。
传代：
备注：由于人间充质干细胞完全培养液是低血清培养液，需要提前取少量人间充质干细胞完全培养液，额外加入10% FBS，作为胰酶消化终止液使用。
  1. 待细胞长到70%-80%满时进行传代，一般3-5天，具体视细胞生长情况而定。
  2. 吸除废液。
  3. 用PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。
  4. 加入1-2 ml的0.05%胰酶（含EDTA）至培养瓶，轻轻晃动，使胰酶覆盖底面，置于37℃培养箱内消化细胞。
  5. 在显微镜下观察，直至细胞层全部脱落（一般需要1-2 min）。
  6. 加2 ml 胰酶消化终止液（即备注中：额外加入10%FBS的人间充质干细胞完全培养液）终止消化。
  7. 1000 rpm离心5 min，去上清，加入人间充质干细胞完全培养液2 ml。
  8. 多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液。
  9. 按照1:2-1:3的比例进行传代。
  10. 放入37℃培养箱内培养。

冻存：

  1. 按传代的方法将细胞消化下来，制成细胞悬液。
  2. 以1000 rpm，离心5 min，弃上清，逐滴加入已经预冷的冻存液，悬浮细胞。
  3. 按每支冻存管内加入500 ml细胞悬液分装到冻存管内，标记细胞名称、代数、冻存日期等基本信息。
  4. 将冻存管置于程序降温盒内，-80℃过夜，转入液氮。

冻存液配方：
人间充质干细胞完全培养液60%，FBS 30%，DMSO 10%

人脂肪间充质干细胞培养Protocol

复苏：

  1. 将人脂肪间充质干细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
  2. 将冻存管内细胞悬液转移至含3-4 ml 人间充质干细胞（hMSC）完全培养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min。
  3. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的人间充质干细胞完全培养液2 ml，吹打悬浮。
  4. 轻轻吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。
  5. 按照人脂肪间充质干细胞说明书中建议复苏培养体系转移至一个T25培养瓶中培养，加入培养液6 ml。
  6. 放入37℃培养箱内培养。
  7. 复苏第二天观察，如死细胞较多，更换新鲜的人间充质干细胞完全培养液，可以使细胞生长的更好。
传代：
备注1：由于人间充质干细胞完全培养液是低血清培养液，需要提前取少量人间充质干细胞完全培养液，额外加入10% FBS，作为胰酶消化终止液使用。
备注2：细胞不能太密集，否则容易分化。
  1. 待细胞长到70%-80%满时进行传代（见备注2），一般3-5天，具体视细胞生长情况而定。
  2. 吸除废液。
  3. 用PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。
  4. 加入1-2 ml的0.05% 胰酶（含EDTA）至培养瓶，轻轻晃动，使胰酶覆盖底面，置于37℃培养箱内消化细胞。
  5. 在显微镜下观察，直至细胞层全部脱落（一般需要1-2 min）。
  6. 加2 ml 胰酶消化终止液（即备注1中：额外加入10% FBS的人间充质干细胞完全培养液）终止消化。
  7. 1000 rpm离心5 min，去上清，加入人间充质干细胞完全培养液2 ml。
  8. 多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液。
  9. 按照1:2-1:3的比例进行传代。
  10. 放入37℃培养箱内培养。

冻存：

  1. 按传代的方法将细胞消化下来，制成细胞悬液。
  2. 以1000 rpm，离心5 min，弃上清，逐滴加入已经预冷的冻存液，悬浮细胞。
  3. 按每支冻存管内加入500 ml细胞悬液分装到冻存管内，标记细胞名称、代数、冻存日期等基本信息。
  4. 将冻存管置于程序降温盒内，-80℃过夜，转入液氮。

冻存液配方：
人间充质干细胞完全培养液60%，FBS 30%，DMSO 10%

小鼠胚胎干细胞（mES细胞）、小鼠iPS细胞培养Protocol

MEF细胞铺制：

  1. 在T25培养瓶中加入0.2%明胶，摇匀后覆盖底面即可，于37℃细胞培养箱至少放置15 min以上。
  2. 吸除0.2%明胶，加入事先水浴加热至37℃的MEF完全培养液。一般地，一个T25培养瓶中加入5 ml MEF完全培养液。
  3. 按实验需要：小鼠胚胎干细胞使用KM-r P3 MEF或CF-1 P3 MEF；小鼠iPS使用ICR-r P3 MEF，复苏MEF细胞若干支。将冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
  4. 将冻存管内细胞悬液转移至含2 ml MEF完全培养液的15 ml离心管内，以    1000 rpm，离心5 min，离心后将上清液吸除，另加入新鲜的MEF完全培养液1 ml，重悬后按照一个T25培养瓶铺1´106的MEF细胞，平均加入到T25培养瓶中，轻轻摇匀后置于37℃细胞培养箱。24 h以后可以传入小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞。
  5. 复苏或传代小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞前，将T25培养瓶中的MEF完全培养液吸除，加入2 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液轻轻冲洗一遍后吸除，加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液待用。

复苏：

  1. 将小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
  2. 将冻存管内细胞悬液转移至含3-4 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min。
  3. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液2 ml，吹打悬浮。
  4. 重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。
  5. 转移至1个已经铺好MEF细胞的T25培养瓶中培养。
  6. 每天更换小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液。

传代：

  1. 一般在复苏后第2-3天传代，视克隆大小和密度而定。
  2. 吸除废液。
  3. 用PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。
  4. 加入1.0 ml的0.25%胰酶（含EDTA）至培养瓶，轻轻晃动，使胰酶覆盖底面，置于37℃培养箱内消化细胞。
  5. 在显微镜下观察，直至细胞层全部脱落（一般需要1-2 min）。
  6. 加2 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液终止消化。
  7. 多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液。
  8. 加入足量的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液，吹打混匀，细胞悬液分装到铺好MEF细胞的T25培养瓶中。一般地，一个T25培养瓶加入5-6 ml培养液。
  9. 放入37℃培养箱内培养。
  10. 每天换液。

传代比例：1:4-1:7

冻存：
  1. 按传代的方法将细胞消化下来，制成细胞悬液。
  2. 以1000 rpm，离心5 min，弃上清，逐滴加入已经预冷的冻存液，悬浮细胞。
  3. 按每支存管内加入500 ml细胞悬液分装到冻存管内，标记细胞名称、代数、冻存日期等基本信息。
  4. 将冻存管置于程序降温盒内，-80℃过夜，转入液氮。

冻存液配方：
小鼠胚胎干细胞完全培养液或小鼠iPS完全培养液60%，ES级FBS 30%，DMSO 10%

附：小鼠胚胎干细胞与MEF细胞分离的简易方法（差速贴壁法）：
  1. 培养中的小鼠胚胎干细胞，按传代的操作方法将细胞用胰酶消化并吹打成单细胞悬液后，加入适量的提前温育好的小鼠胚胎干细胞完全培养液重悬细胞，吹打混匀，细胞悬液分装到无MEF细胞的培养皿或培养瓶（一般地，一个T25培养瓶中培养的小鼠胚胎干细胞，在一个10 cm培养皿中进行差速贴壁。不要事先铺明胶，如铺明胶则细胞贴壁速度过快无法有效分离小鼠胚胎干细胞与MEF细胞）中。
  2. 培养皿或培养瓶置于37°C培养箱内静置1小时。
  3. 1小时后，绝大部分MEF细胞已贴在培养皿或培养瓶底面，而大部分小鼠胚胎干细胞仍然悬浮在培养液中。
  4. 收取培养液，进行后续实验。
小鼠胚胎干细胞（mES细胞）、小鼠iPS无饲养层培养Protocol
复苏：
  1. 在T25培养瓶中加入0.2%明胶，摇匀后覆盖底面即可，于37℃细胞培养箱至少放置15 min以上。
  2. 吸除0.2%明胶，加入事先水浴加热至37℃的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞培养液5 ml。
  3. 将小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
  4. 将冻存管内细胞悬液转移至含3-4 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞培养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min。
  5. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞培养液2 ml，吹打悬浮。
  6. 重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。
  7. 转移至1个已经包被过明胶的T25培养瓶中培养。
  8. 每天更换小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞培养液。

传代：

  1. 一般在复苏后第2-3天传代，视克隆大小和密度而定。
  2. 吸除废液。
  3. 用PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。
  4. 加入1.0 ml的0.25%胰酶（含EDTA）至培养瓶，轻轻晃动，使胰酶覆盖底面，置于37℃培养箱内消化细胞。
  5. 在显微镜下观察，直至细胞层全部脱落（一般需要1-2 min）。
  6. 加2 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞培养液终止消化。
  7. 多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液。
  8. 加入足量的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞培养液，吹打混匀，细胞悬液分装到预先包被过0.2%明胶的T25培养瓶中。一般地，一个T25培养瓶中加入5-6 ml培养液。
  9. 放入37℃培养箱内培养。
  10. 每天换液。

传代比例：1:4-1:7

冻存：

  1. 按传代的方法将细胞消化下来，制成细胞悬液。
  2. 以1000 rpm，离心5 min，弃上清，逐滴加入已经预冷的冻存液，悬浮细胞。
  3. 按每支存管内加入500 ml细胞悬液分装到冻存管内，标记细胞名称、代数、冻存日期等基本信息。
  4. 将冻存管置于程序降温盒内，-80℃过夜，转入液氮。

冻存液配方：
小鼠胚胎干细胞培养液或小鼠iPS培养液80%，ES级FBS 10%，DMSO 10%

小鼠神经干细胞培养Protocol
复苏：
  1. 将小鼠神经干细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
  2. 将冻存管内细胞悬液转移至含3-4 ml小鼠神经干细胞完全培养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min。
  3. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的小鼠神经干细胞完全培养液2 ml，吹打悬浮。
  4. 轻轻吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。
  5. 按照小鼠神经干细胞说明书中建议复苏培养体系转移至一个T25培养瓶中培养，加入培养液6 ml。
  6. 放入37℃培养箱内培养。
  7. 复苏第二天观察，如死细胞较多，更换新鲜的小鼠神经干细胞完全培养液，可以使细胞生长的更好。
传代：
  1. 待细胞长到80%满时进行传代，一般2-3天，具体视细胞生长情况。
  2. 吸除废液。
  3. 用PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。
  4. 加入1-2 ml的0.05%胰酶（含EDTA）至培养瓶，轻轻晃动，使胰酶覆盖底面，置于37℃培养箱内消化细胞。
  5. 在显微镜下观察，直至细胞层全部脱落（一般需要5-15 min）。
  6. 加2 ml小鼠神经干细胞完全培养液终止消化。
  7. 1000 rpm离心5 min，去上清，加入小鼠神经干细胞完全培养液2 ml。
  8. 多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液。
  9. 按照1:4-1:10的比例进行传代。
  10. 放入37℃培养箱内培养。

冻存：

  1. 按传代的方法将细胞消化下来，制成细胞悬液。
  2. 以1000 rpm，离心5 min，弃上清，逐滴加入已经预冷的冻存液，悬浮细胞。
  3. 按每支冻存管内加入500 ml细胞悬液分装到冻存管内，标记细胞名称、代数、冻存日期等基本信息。
  4. 将冻存管置于程序降温盒内，-80℃过夜，转入液氮。

冻存液配方：
小鼠神经干细胞完全培养液 90%，DMSO 10%

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