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支原体检测服务

细胞培养中的支原体污染会改变正常细胞的结构和功能。支原体能抑制细胞代谢和生长，改变核酸合成，影响细胞抗原性，导致染色体改变，干扰病毒复制以及模仿病毒的作用。支原体污染的小鼠胚胎干细胞会失去生殖系嵌合的能力。从支原体污染细胞获得的实验数据极不可靠，严重影响了您的研究工作。目前通过微生物培养方法和DNA染色法可以检测出细胞培养中绝大部分的支原体。
    
    中科院细胞库/中科院干细胞库从2007年4月1日推出用DNA染色法和培养法检测支原体的服务。
    收费标准如下：DNA染色法检测每份送检样品收费为300元；培养法检测每份送检样品收费为300元。
    如有需要，请按下列要求收集培养液后送至细胞库2楼夏晴收。
    
    样品准备要求：
    1.将细胞在无抗生素的培养液中传代两次。
    
    2.接近长满并且三天之内没有换液的细胞培养物，在无菌条件下用无菌离心管收集上清液3ml以上。
    
    3.做好标记后送到细胞库。
    
    每周一至周四上午接收样品， 两周内提供检测报告。检测报告包括阳性对照，阴性对照，送检样品的DNA荧光染色照片和培养法结果报告。
    
    联系人及电话：夏晴 54921397 陈松华 54920404 肖磊 54921386
    地 址：岳阳路320号细胞库
    
    附：支原体检测方法
    DNA染色：
    1.将两片盖玻片放到60×15mm玻璃培养皿中，121℃湿热灭菌20分钟。
    2.向每个培养皿中加入3ml DMEM。确认盖玻片是浸没在培养液中而不是漂在液面上。
    3.用上述培液将非洲绿猴肾细胞系Vero制成1.0×104细胞/ml的单细胞悬液。
    4.向每个培养皿中接种细胞悬浮液。
    5.在37℃、5％CO2-95％空气培养箱中培养过夜。
    6.显微镜下观察细胞是否已贴在盖玻片上。在每个培养皿盖上编号以标记接种样品。
    7.向阴性对照培养皿中各加入100μl培养液。
    8.向样品培养皿中各加入100μl的样品(接近长满并且三天之内没有换液的细胞培养物。其上清液可做为样品)。
    9.向阳性对照培养皿中加入100μl B6yH4上清液（已知支原体阳性）。
    10.将培养物重新放回CO2培养箱中培养4天。
    11.盖玻片的固定、染色和封存
    a.取出盖片，用D-Hanks液漂洗，以固定液(乙酸：甲醇＝1：3)固定两次，分别为5分钟和10分钟。
    b.吸出固定液，让培养物风干。
    c.用Hoechst 33258染液染色30分钟。
    d.干燥后封片。
    
    
    
    肉汤培养法：
    1.选择接近长满并且三天之内没有换液的细胞培养物。
    2.取出3-5ml培养液做为样品。
    3.用一次性无菌刮片刮下一部分单层细胞放到剩下的培养液中。
    4.将待检细胞上清液接种到支原体肉汤培养物中，pH6.5和pH7.6的肉汤各0.3-0.5ml。
    5.于37℃下需氧条件培养肉汤培养物4天以上，观察pH变化以判定污染情况。

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